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线粒体膜电位检测(JC-1)

提示:

大量的研究表明线粒体与细胞凋亡密切相关,其中线粒体跨膜电位(△y)的破坏,被认为是细胞凋亡级联反应过程中最早发生的事件之一

   大量的研究表明线粒体与细胞凋亡密切相关,其中线粒体跨膜电位(△y)的破坏,被认为是细胞凋亡级联反应过程中最早发生的事件之一,它发生在细胞核凋亡特征(染色质浓缩、DNA断裂)出现之前,一旦线粒体跨膜电位崩溃,则细胞凋亡不可逆转.
    JC-1(5,5’,6,6’-tetrachloro-1,1’,3,3’-tetraethylbenzimidazolcarbocyanine iodide)是一种阳离子脂质荧光染料,可作为检测线粒体跨膜电位指示剂.JC-1有单体和多聚体两种存在状态,在低浓度时以单体的形式存在,高浓度时以多聚体形式存在,两者的发射光谱不同,但均可在流式细胞仪绿色(FL-1)通道检测出绿色荧光,JC-1可透过正常细胞膜以单体状态聚集胞内,正常健康线粒体的膜电位(△y)具有极性,JC-1依赖于△y的极性被迅速摄入线粒体内,并因浓度增高而在线粒体内形成多聚体,多聚体发射光为红色荧光;可被流式细胞仪的红色(FL-2)通道检测到,而细胞发生凋亡时,线粒体跨膜电位被去极化,JC-1从线粒体内释放,红光强度减弱,以单体的形式存在于胞质内发绿色荧光.根椐这一特征检测线粒体膜电位的变化.
    所需仪器或者试剂:流式细胞仪或荧光显微镜、高速离心机、CO2培养箱、微量移液器、1.5m L  Microtube、载玻片、盖玻片(荧光显微镜观察需用)、PBS、灭菌去离子水
    使用注意事项
1. 微量试剂取用前请离心集液.
2. JC-1避光保存及使用.
3. 细胞培养的数量不宜超过1×106,否则细胞会产生自然凋亡影响检测.
4. 对PH变化过于敏感的细胞建议用胎牛血清取代Buffer孵育染色及洗涤,或延长观测时间
5. 流式细胞仪检测线粒体膜电位变化受到多种因素的影响,因诱导剂、细胞株类型,作用时间的不同而荧光强度比例都有不同,因此没有通用标准的补偿设门指南,因此每个试验需设阴性及阳性对照组进行荧光补偿及设门.
6. 组织需先制备单细胞悬液或提取纯化线粒体后方可进行检测,可选用凯基细胞悬液制备试剂盒(KGA829)或线粒体提取试剂盒(KGA827).
    操作方法
1.   用适当的方法诱导细胞凋亡,同时设立阴性对照组和阳性对照组【用适当的凋亡诱导剂(如星形孢菌素,staurosporine),诱导适当时间后经其它检测(如AnnexinV或 Caspase 3活性)证实确有凋亡产生】,收集细胞;
2.   用PBS洗涤细胞二次(离心2000rpm,5min),收集不多于1×106的细胞;
3.   取100μL 10× Incubation Buffer加900μL灭菌去离子水稀释成1× Incubation Buffer,混匀并预热至37℃;
4.   吸取500μL  1× Incubation Buffer,加入1μL JC-1,涡旋混匀配成JC-1工作液;
    【因JC-1在水中的溶解度很小,所以可以通过离心的方法(10,000rpm,1min)去除不溶的颗粒,吸取离心后的上清使用,以消除干扰】
5.   取500μL JC-1工作液将细胞均匀悬浮,37℃,5%CO2的培养箱中孵育15~20min;
6.   室温离心(2000rpm,5min)收集细胞,用1× Incubation Buffer洗两次;
7.   吸取500μL  1× Incubation Buffer重新悬浮细胞;
8.   荧光显微镜观察或流式细胞仪分析.
    荧光显微镜观察
1.   滴一滴上述细胞悬液于载玻片,盖上盖玻片,于荧光显微镜下观察;
2.   对于贴壁细胞来说,也可直接用盖玻片来培养细胞并诱导细胞凋亡;用PBS洗涤细胞两次;
    滴加100μL JC-1工作液,加盖玻片,37℃,5%CO2的培养箱中孵育15~20min;1× Incubation Buffe洗涤1~2遍;将盖玻片倒置于载玻片上,于荧光显微镜下观察;
    正常细胞:双色滤光片观察则为:绿++  红++(高绿高红),如在同一滤光片下观察则为黄绿色
    凋亡细胞:双色滤光片观察则为:绿++ 红+(高绿低红), 如在同一滤光片下观察则为绿色
    流式细胞仪分析
    用流式细胞仪检测(Ex=488 nm; Em=530 nm)细胞凋亡的情况,绿色荧光通过FITC通道通常为FL1来检测;红色荧光通过PI通道通常为FL2来检测..正常细胞{FL-1亮,FL-2亮; R1},凋亡细胞 {FL-1亮, FL-2暗; R2},设门的位置根椐细胞种类、实验条件等不同而变化,试验需设未经处理的正常细胞为阴性对照组和阳性对照组,根椐阴性和阳性对照组的双参数散点图来设定门的位置.


(责任编辑: 佚名 )

  • 本文关键字:电位 检测 

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