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HIV的生活周期

提示:

HIV的生活周期与一般的逆转录病毒类似.都经历了结合靶细胞受体、包膜与细胞膜融合、病毒核心进入细胞浆、逆转录、病毒DNA入细胞

    HIV的生活周期与一般的逆转录病毒类似.都经历了结合靶细胞受体、包膜与细胞膜融合、病毒核心进入细胞浆、逆转录、病毒DNA入细胞核和整合入宿主DNA中、病毒RNA转录和出核、翻译病毒蛋白质以及装配病毒颗粒、出芽和成熟等等过程 (图13-3).


 


图13-3  HIV的生活周期



一、病毒颗粒与细胞表面的受体结合
    作为感染宿主细胞的第一步,成熟的HIV病毒颗粒利用其表面的gp120与靶细胞膜表面的CD4分子相结合.CD4分子上D1区域被认为是与gp120结合的区段,点突变的实验结果更进一步证实Phe43和Arg59是与gp120结合的位点.除CD4作为受体外,gp120由于构象的改变再进一步与CXCR4或CCR5(共受体)结合.CCR5或CXCR4本是T细胞或巨噬细胞表面上结合趋化因子的天然受体. HIV感染靶细胞时却利用了这一分子作为其共受体. Gp120利用其V3片段以及少许V1/V2片段结合共受体. 需要强调的是在疾病的早期HIV常常利用CCR5作为受体,而病程恶化时病毒常常用CXCR4作为受体.利用CCR5的病毒与利用CXCR4的病毒常常有很多不同的特征.如前者常为传播时起作用的病毒,在细胞培养中不易形成合胞体,一般只感染巨噬细胞及外周血淋巴细胞;而后者常常在疾病恶化时发展成爱滋病时出现,在细胞培养中形成合胞体,一般只感染T细胞株以及外周血淋巴细胞.为了描述的方便, 利用CCR5受体的病毒被称为R5病毒, 而利用CXCR4的病毒被称为X4病毒.
    与CD4和CXCR4(或CCR5)的结合将导致gp120的构象改变,从而暴露出被其掩蔽的gp41.当gp120与受体结合后发生构象改变, 对于gp41的屏蔽作用减弱.直立起来的gp41膜外段的结构,也许是由于中部亮氨酸拉链保守序列的卷曲螺旋结构的作用,将象弹簧一样把位于gp41 N端的融合基团弹入靶细胞膜中.之后位于N端的亮氨酸拉链序列将再折转,与位于C端的亮氨酸拉链序列相结合.这一系列反应的后果,是拉近病毒包膜与细胞膜的距离,继而引发病毒包膜与细胞膜的融合.膜融合是一个蛋白质相互作用的过程.估计大约4~6个CCR5受体,多个CD4分子以及3~6个病毒包膜蛋白三聚体共同参与,从而形成一个融合孔.
    通常,病毒包膜与细胞膜的融合发生于内涵体(endosome) 内,而且是一个依赖于pH的过程.一般说来,在酸性环境里,病毒上的膜蛋白与受体结合而导致构象改变,继而导致膜-膜融合.然而, HIV与其它病毒不同,内涵体的吞入(endocytosis)和酸性环境不是其进入细胞所必需的. 在细胞膜的表面也能观察到大量的膜膜融合.换言之, HIV病毒可以直接从细胞的表面直接经膜融合后进入细胞浆.
    除了经由成熟病毒颗粒感染以外, HIV也可经由细胞与细胞之间的接触而直接由感染细胞到未感染细胞.这种感染效率通常要比经由病毒颗粒感染靶细胞要高100倍以上.抗病毒的中和抗体不能抑制病毒由巨噬细胞向CD4+细胞的直接扩散, 证实了这一现象的存在.另外, 有证据表明,在这种直接的传播过程中, 病毒的颗粒可能还没有完全形成.甚至可能只是病毒的核心部分参与了转移过程, 然而逆转录仍然是这一转移过程所必须的.
    近来, 一种新型的病毒与细胞的关系引起了广泛的注意.在淋巴组织和粘膜下层中存在着一种树突状细胞.很早以前人们就发现树突状细胞能将病毒颗粒完整地包裹起来而又不至于失活和吞噬,在适当的时候,再将病毒颗粒传递给CD4+细胞.近来在树突状细胞的表面上发现了一种叫DC-SIGN (dendritic cell-specific intracellular adhesion molecule(ICAM)-grabbing nonintegrin,DC-SIGN)的糖蛋白.DC-SIGN能够特异地、高亲和性地与HIV的gp120结合.这种结合的结果并非是将HIV导入树突状细胞,而是将其传递给其它靶细胞,提高病毒颗粒与靶细胞结合的机会,从而提高病毒感染的效率.另外,还能有效地保持病毒的传染性达数天之久.

二、逆转录、入核和整合
    当病毒颗粒成熟后,逆转录酶立即利用病毒颗粒内的dNTPs开始少量的DNA合成.这一过程被称为自然发生的内源性逆转录(nature endogenous reverse transcription, NERT).病毒进入细胞浆后,表面上的膜以及内衬于膜的绝大多数p17已经不再与病毒核心(viral core)相联.在病毒核心中,或病毒核心的衍变物中,逆转录立即利用胞浆中的dNTPs,在有其它细胞因子(如精眯、精胺)的参与下,开始了病毒DNA的合成.
    这一过程已在第四章详细描述,这里就不再重复.与宿主细胞的DNA合成不同,逆转录过程不是对称性的.其过程是首先以RNA为模板合成DNA负链,在RNA酶H降解了RNA模板后,再以负链DNA为模板合成正链DNA.在这一过程中,相对于RNA模板而言,一个额外的U3片段出现在新合成双链DNA的5’末端,而一个额外U5片段出现在3’末端,U3区提供了很多转录因子的结合部位,从而构成了原病毒DNA的增强子和启动子.另外,新加上的U3和U5片段也包含了下一步用于整合的特殊信号.
    与一般的C型逆转录病毒不同,HIV以及其它慢病毒能够感染处于分裂静止期(G0/G1)的细胞,如巨噬细胞、神经元以及部分T细胞.其中的一个原因是HIV逆转录酶能够在dNTPs处于极低的浓度下(如静止期细胞的胞浆中)还能够缓慢地完成DNA的合成.与C型逆转录病毒的另一个显著的不同是,HIV的DNA在静止期细胞的胞浆中合成后,与其它病毒蛋白,譬如整合酶、NC蛋白、Vpr和磷酸化的MA,形成整合前复合物(pre-integration complex, PIC),能够穿过核膜上的核孔进入细胞核.而C型反向病毒的PIC却没有这一功能.只有当细胞开始分裂进入M期,核膜消失后C型反向病毒的PIC才能与宿主DNA相遇.HIV的这一特性可能是缘于几个原因:
1、部分磷酸化的p17(MA)仍然是PIC的一部分,而HIV的p17上携带有很强烈的入核信号序列.这些氨基酸基因能够与输入蛋白结合而由后者引导HIV的PIC进入细胞.
2、Vpr也能在入核过程中起一定作用.
3、HIV的整合酶也能够与输入蛋白相结合,从而使得HIV的PIC有穿越核孔的功能.
4.最近有很多资料表明,HIV逆转录的最终产物-双链线状DNA不是一般意义的线状DNA,其正链的中间部分并没有完全的闭合,而是存在着一个可称之为“翻卷”(flap)的结构:即cPPT所启动的新合成的正链DNA由一称为核酸链置换(strand displacement)的DNA合成方式开始,而这一掀起的部位并不很长,在cPPT的下游几百碱基对处停了下来,从而形成一个所谓的“翻卷”.这一“翻卷”被证明对HIV穿过核孔起了极为重要的作用.然而,其作用机理尚不明确.
    当病毒线性DNA在胞浆完成了合成以后,下一步就是移动到细胞核内整合到宿主的染色质DNA中去,与染色质DNA共同经历DNA复制和细胞分裂.而整合也是HIV病毒完成其生活史的必须步骤.催化这一过程的是逆转录病毒与pol基因所编码,并且由蛋白酶从pol前期产物中切割下来的整合酶.逆转录过程是除逆转录病毒外很多病毒和细胞生化反应过程所共有的,而整合DNA入宿主细胞DNA却为逆转录病毒所特有.整合到宿主DNA后的病毒DNA被称为“前病毒”(provirus),两个相同的LTR分别位于5’末端与3’末端.然而,在整合过程中,病毒DNA的两端都要失去两个碱基,最后留在两端的碱基也总是5’-TG……CA-3’.直接相连的染色质DNA序列都有两个相同的4~6重复的碱基.与这相连的染色质DNA序列却是非特异性的,说明DNA整合部位是一个随机的过程.有报道说整合部位常常位于转录比较活跃区段.因为转录过程需要染色质解开高度超螺旋的DNA.由此暴露出松散的DNA部位以便于整合.
    线状的病毒DNA的两端在刚完成逆转录时都是平钝的.这一线状的DNA正是整合的前体物.在胞浆或细胞核中,整合细胞首先对线状DNA的平钝末端进行处理(processing).两个3’终端的碱基被切除,留下5’-CAOH-3’位于3’终端.这一CAOH双碱基是所有逆转录病毒所保留的.若对这一序列作点突变,整合酶对平钝末端的处理就不可能完成.接下来形成二聚体的整合酶将经处理过的两端靠拢,并催化病毒DNA的两末端CA-OH3’末端羟基基团分别攻击位于染色质DNA正负链上的磷酸基团.这两个分别位于染色质DNA正链和负链上的磷酸基团相隔大约4~6个碱基对.这一转移基团的结果将使得病毒DNA的正链和负链与宿主DNA的正链和负链各自相连接.而这一转移与连接过程,将在染色质DNA 的正负链上各自留下4~6个失去配对的碱基.宿主中的DNA修复系统将自动将这两个缺口加以修复.另一方面,也对病毒DNA上多余的两个未配对的碱基(通常是AA)加以剪除.至此,病毒DNA被整合到宿主DNA中.宿主蛋白质也许参与了这一整合过程.近来有实验指出HMG、INI等宿主蛋白可能也在HIV-1的DNA整合过程中起了一些辅助作用.

三、RNA的转录、剪接和进入胞浆
    一旦HIV DNA整合入宿主DNA中,此DNA即被称为“前病毒(provirus)”.5’末端的U3片段是增强子和启动子的所在地,富含几十种转录因子的结合位点,其中有一个NF-kB的结合位点.NF-kB在激活的T细胞中能与它的抑制物在细胞浆中解离,进入细胞核激活HIV-1的转录.
    HIV的转录受到HIV特异的调控系统调节,这就是Tat/TAR系统.R区段是HIV mRNA转录的起点.这一起点紧接着的就是一个非常特殊的RNA结构,即TAR(Tat-activation region).TAR RNA形成了一个稳定的有杆(stem)、有角(bulge)、也有环(loop)的结构.Tat结合在TAR的角的位置上,而细胞蛋白质Cyclin-T和CDK9激酶结合到TAR的环,而Tat与Cyclin-T又紧密结合.CDK9激酶可以超磷酸化RNA聚合酶II的C端.由此对转录的激活有双重作用:(1)Tat-TAR在转录的起始点结合,有益于增加稳定的RNA聚合酶Ⅱ起动复合物的数目;(2)通过防范提前终止以增加转录的延长.
    HIV mRNA完成转录后,有两个后果:一是被剪接成各种mRNA;二是不被剪接而是直接被转运到细胞浆中作为合成Gag或Gag-Pol蛋白质的模板或直接被包装入病毒颗粒中.而HIV编码的另一个重要的调节蛋白Rev对这一过程起了关键作用.它通过结合位于编码gp41(TM)的位置上的一个特殊的RNA结构而起作用.这一特殊的RNA结构被称为RRE(Rev-responding element),由五个杆-环结构组成.杆-环结构Ⅱ是Rev的结合位点.在HIV mRNA(gag-pol RNA)结构中,存在着很多不稳定的结构(instability element, INS)它们的存在将诱导剪辑过程的进行.而Rev-RRE的结合不仅能阻止这一过程的进行,而且还将与细胞核中的转运系统相互作用,把HIV RNA送出胞浆.现已证明Rev是一种穿梭蛋白质,在结构上同时存在着入核信号和出核信号.当Rev与RRE结合时,入核信号就被这一蛋白质-RNA结合所屏蔽.而出核信号与输出蛋白(exportin-1,XPO) 和Ran-GTP结合,把Rev-RRE送出核外.出核后在胞浆的Ran-GTP酶-激活蛋白(Ran-GTPase-activating protein, GAP)将GTP水解,从而诱导含有RRE的HIV RNA与Rev分离.游离的Rev则又暴露其入核信号,因而重新进入核内搬运新转录的病毒RNA.
    在病毒刚开始表达mRNA时,Rev的含量还很少,此时核内的mRNA将被剪接成各种编码早期蛋白质(Tat,Rev,Nef)的mRNA.当这些早期蛋白质,尤其是Rev累积到一定浓度时,Rev就将与RRE结合,从而使未受剪接的mRNA或受到剪接但含有INS和RRE的mRNA从细胞核进入细胞浆,因而有了Gag、Pol、Env、Vif、Vpr以及Vpu等晚期蛋白质的表达.由此看来,Rev是早期蛋白质表达转换到晚期蛋白质表达的主要调控蛋白质.

四、结构蛋白质的表达、RNA包装以及病毒颗粒的装配和成熟
    HIV mRNA进入胞浆后,将利用核糖体翻译成各种结构蛋白和附属蛋白质.例如Vif、Vpr和Vpu. Gag和Gag-pol的合成比例为20:1,主要由-1阅读框漂移所控制.
    未被转录的RNA模板将与Gag蛋白特异地结合,被包装进入病毒颗粒.Gag蛋白之所以能够从众多的细胞mRNA中特异地识别HIV RNA模板,是因为在HIV RNA的5’末端存在着一特异的RNA序列和结构能够被Gag识别.此结构被称为包装信号.一旦此序列被删除掉,Gag蛋白也就再也不能将RNA模板带入病毒颗粒.RNA在被包装的同时也会进行一系列的构象变化,其中较为突出的是RNA发生二聚体化.一个近来得到广泛承认的“kissing-loop”模型较好地解释了这一过程.此假说认为二聚体化是分两部分来完成的.首先是二聚体的接触,其后是二聚体的成熟.刚开始时是两条RNA的5’末端相互以氢键吸引而使得两条RNA链相互结合,继而由于两链之间存在着部份碱基互补的区域,它们相互找到最佳互补序列而结合,从而达到二聚体的“成熟”.成熟后的二聚体由于有碱基互补的片段,其Tm也相应提高.在体外实验条件下,只有温度升高到一定水平才有可能将它们分开.另外,tRNA的 一段与引物结合位点(primer bind site) 因碱基互补粘合在一起.但要指出的是:各种逆转录的病毒所用的tRNA不完全一样.HIV用tRNAlys而MMLV用tRNApro.
    必须指出的是,HIV以及慢病毒象其它C型逆转录病毒一样,其装配是在细胞膜的内面进行的.由于其N端MA(p17)部分豆蔻酰化,于是Gag和Gag-Pol融合蛋白将与细胞膜结合而紧密地衬在膜的内面.RNA的包装也多发生在此处.这些集聚的Gag和Gag-Pol继而出芽(budding).与此同时,由核糖体翻译的包膜蛋白gp160也因其N端的分泌信号而由核糖体直接进入粗面内质网的内腔,再被转运到高尔基体进行糖基化.在此处细胞的蛋白酶还会将gp160切开成为gp120和gp41.之后,这些包膜蛋白将被转运到细胞膜的表面,与正在出芽的Gag MA相结合,从而使包膜蛋白也被浓缩于出芽的病毒颗粒上.最后,病毒颗粒脱离细胞膜而成为一个独立的病毒粒子(virion).
    在出芽的过程中或晚期,病毒颗粒中的Gag-Pol融合蛋白也许在随机的二聚体结合中产生微弱的蛋白酶活性.这些融合蛋白按多肽链上的蛋白酶切位点被切割开来,切割下来的少量蛋白酶将形成二聚体,又将更多的蛋白酶切割下来.这些蛋白酶二聚体将在所有的蛋白酶切割点发挥作用,从而将Gag中的p17、p24、p7、p6以及Pol 中的PR、RT、IN酶全部切割开来.这些蛋白质和RNA模板又再进一步地组合,最后形成有传染性的成熟的病毒颗粒.这一过程主要由蛋白酶来完成,称为“成熟”(maturation).
    至此,一个HIV生活周期得以完成.

五、HIV感染的潜伏状态
    HIV在感染了细胞的另一种形式,是没有新的病毒产生.相反,相当一部分的病毒在细胞里只是完成了其生活史的一部分,在时机有利时又再继续完成其余的步骤.HIV的这一特点对于其在体内逃避免疫系统的识别和攻击,长期生存有极其重要的意义.根据生活史的特点,潜伏感染又分为整合前潜伏和整合后的潜伏.
    整合前的潜伏可以出现在两个阶段,(1)病毒开始了逆转录,然而由于dNTPs和其它细胞因素(如精脒和精胺)的不足,病毒DNA的复制只是部分完成;(2)病毒完成了DNA的合成,但未能进一步的整合.整合后的潜伏时期,病毒DNA整合到宿主的DNA中,仅有前期蛋白质(Tat、Rev和Nef)的少量表达.然而由于Rev蛋白质的表达不足,未能使病毒蛋白质合成从早期转向晚期,这一现象不仅在某些细胞株(如U1,ACH-2)可以观察到,在艾滋感染者的外周CD4淋巴细胞中也可以见到.

 


(责任编辑: 佚名 )

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